Além do risco de contrair infecções, o acidente de trabalho, com exposição a material biológico, pode acarretar graves repercussões psicossociais no pessoal de saúde, levando-os à mudanças nas relações de trabalho, familiares e sociais. Todavia, apesar dos avanços nos marcos legais ou normativos, a real situação brasileira sobre os indicadores de exposição aos agentes biológicos apresenta inúmeras lacunas. Objetivo: validar instrumento de pesquisa para avaliar conhecimentos, atitudes e prática do pessoal de saúde sobre exposição ocupacional a material biológico em serviços de saúde. Metodologia: estudo descritivo e exploratório, com análise dos dados através de uma abordagem qualitativa e quantitativa. Teve como participantes o pessoal de saúde lotado no hospital universitário, que aceitou voluntariamente participar da pesquisa, sendo a coleta de dados na primeira etapa da pesquisa efetuada pela autora utilizando instrumento impresso e a segunda etapa realizada pesquisa online (questionário eletrônico). A consistência interna de cada categoria e domínio foram avaliados pelo coeficiente alfa (α) de Cronbach; realizada purificação da escala; análise semântica com população-meta; e análise fatorial como método para fins de redução de variáveis observadas. Dados organizados no programa EpiData 3.1 e análise executada pelo programa estatístico SPSS 17.0. Resultados: na fase qualitativa da pesquisa, a validade de conteúdo do instrumento com 81 itens foi obtida após entrevista e preenchimento do instrumento. Na fase quantitativa, os valores de α revelaram confiabilidade do questionário de moderada a elevada (0,60 – 0,90) entre os itens e os domínios. Após purificação da escala, com eliminação de alguns itens para verificar mudanças na consistência interna, o coeficiente α foi elevado (0,75 – 0,90). Por sua vez, após análise semântica, alguns itens do questionário foram reestruturados, excluídos 5 itens, e adotada a escala tipo Likert para as respostas. Na pesquisa online (instrumento com 76 itens), após a análise fatorial e análise da consistência interna de cada categoria e domínio, 16 itens foram excluídos, obtendo-se uma escala final com 60 itens. Conclusão: a análise da confiabilidade dos itens por meio do coeficiente de consistência interna alfa de Cronbach, permitiu concluir que a escala é confiável, por apresentar valores de consistência considerados de moderados a elevado, tanto no instrumento em geral, quanto nos seus três domínios. O método aplicado evidencia a complexidade do processo de validação de questionário e do coeficiente α de Cronbach que pode ter aumento expressivo se excluídas questões de baixa ou moderada confiabilidade. Segundo os resultados obtidos pelas análises, conclui-se que o instrumento é uma escala consistente e valida.