Introdução: A tonsilite aguda, de origem viral ou bacteriana, representa um desafio diagnóstico. A distinção inadequada entre as etiologias pode levar ao uso excessivo de antibióticos e à resistência antimicrobiana. Estratégias que integrem a caracterização microbiana e a resposta imunológica local podem aprimorar o diagnóstico diferencial. Objetivo: Identificar um painel de biomarcadores in situ capazes de diferenciar tonsilites bacterianas e virais. Metodologia: Estudo transversal com 197 pacientes atendidos no Hospital Santa Izabel (Salvador,BA) com suspeita clínica de tonsilite aguda, além de 5 controles saudáveis. A inclusão nos grupos baseou-se no Escore de Centor modificado (bacteriana) e na presença de sintomas respiratórios altos com sinais tonsilares (viral). A classificação clínica foi realizada por emergencistas e especialistas. Excluíram-se pacientes com uso recente de antibióticos, anti-inflamatórios ou imunossupressores. Após a coleta das amostras de swab tonsilar, DNA e RNA foram convertidos em cDNA, preparados com painéis direcionados e sequenciados na plataforma Illumina MiSeq. As análises incluíram filtragem do hospedeiro, controle de qualidade, anotação taxonômica e normalização. A análise da metagenômica foi conduzida na plataforma CZID, com filtragem por abundância (≥100 rPM) e exclusão de espécies irrelevantes. Genes de resistência foram identificados com ARIBA e ResFinder. A expressão gênica foi avaliada pela tecnologia nCounter (NanoString). A análise transcriptômica incluiu expressão diferencial (log₂), correção por FDR e enriquecimento funcional (GO, KEGG, Reactome) via gProfiler. Os dados foram filtrados por prevalência (≥20%) e analisados por testes não paramétricos, PLS-DA, clusterização, correlações microrganismo-gene e curvas ROC/PR com validação cruzada 3-fold. Diversidades alfa e beta foram avaliadas com métricas ecológicas e PCoA. Resultados: Foram analisadas 46 amostras (31 virais, 10 bacterianas – emergencistas, 29 virais e 12 bacterianas - especialistas) e 5 controles. A análise metagenômica revelou uma comunidade microbiana complexa nos pacientes e controles saudáveis, incluindo patógenos e comensais. Não houve diferenças significativas nas diversidades alfa ou beta entre os grupos. Genes de resistência foram detectados independentemente da suspeita clínica. A análise da expressão gênica (n=24) distinguiu os grupos de tonsilite aguda. Nos casos bacterianos, houve regulação positiva de genes como IL21R, CD47, ITGAM e CD163, com enriquecimento da via MHC II. Já nos casos virais, genes como HLA-DRB5 e TUBA3E foram regulados positivamente, com enriquecimento da via de tráfego de conexons (p < 0,01). Conclusão: A expressão gênica in situ apresentou maior acurácia diagnóstica do que a simples detecção de patógenos, mostrando-se promissora na diferenciação etiológica. A metagenômica foi limitada pela complexidade inerente a essa análise e devido à diversidade da microbiota presente na cavidade oral.