Avaliação dos mecanismos envolvidos na morte da Leishmania braziliensis por monócitos de pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana - Dissertação de Mestrado 2013
Introdução: Na leishmaniose tegumentar causada por Leishmania braziliensis a patogênese está associada a uma resposta Th1 exagerada e não apropriadamente modulada e existem várias evidências que essa resposta participa do desenvolvimento das lesões cutâneas observadas nessa doença. Cerca de 10% dos indivíduos residentes em uma área de transmissão de L. braziliensis, a despeito da exposição a esse parasito, não apresentam evidências de doença clínica e são considerados como tendo a forma subclínica da doença. Como a resposta imune adaptativa parece não estar envolvida na erradicação do parasito ou no controle da infecção, estudos sobre o papel das células da resposta imune inata no controle da infecção por L. braziliensis têm se mostrado de grande importância. Os monócitos/macrófagos são as principais células que abrigam a Leishmania e a sua ativação depende principalmente da produção de IFN-y por células T e NK, dando início a vários processos celulares como a geração de burst oxidativo. Dois grupos de oxidantes são importantes no controle da infecção por Leishmania, os Reativos de Oxigênio (ROS) e o Óxido Nítrico (NO), que são produzidos em resposta à fagocitose e após a ativação dessas células, respectivamente. Em modelo murino observa-se um importante papel do NO na morte da Leishmania pelos macrófagos, entretanto os mecanismos utilizados por estas células em humanos ainda não são bem estabelecidos. Objetivo: Avaliar o papel do NO e do ROS no controle da infecção por L. braziliensis por monócitos de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e de indivíduos subclínicos (SC). Métodos: Monócitos de pacientes com LC (n=25) e de indivíduos subclínicos (n=09) foram infectados com L. braziliensis na proporção de 5:1 por diferentes períodos de tempo. A avaliação da produção dos radicais oxidativos, através da técnica de citometria de fluxo foi realizada pela oxidação da Dihidrorodamina 123 (DHR-123), após a inibição da produção de NO (LNMMA, inibidor da enzima óxido nítrico sintetase) e após a inibição da produção de ROS (DPI, inibidor da enzima NADPH-oxidase). A produção intracelular do NO e do ROS foi determinada com o uso de sondas intracelulares específicas (DAF FM diacetato e o CMH-2DCFDA) através da citometria de fluxo. Para avaliar os efeitos desses oxidantes no controle da infecção nos monócitos foi utilizada a técnica de microscopia óptica para avaliação do número de células infectadas e do número de amastigotas. Resultados: Após a infecção pela L. braziliensis a expressão do burst oxidativo por monócitos de pacientes com LC foi maior quando comparado com os indivíduos SC e controles sadios. Após a inibição da enzima NADPH oxidase, foi observado uma diminuição significativa da expressão do burst oxidativo por monócitos de pacientes LC sugerindo que haveria maior produção de ROS por essas células. A avaliação da produção intracelular desses oxidantes mostrou que a produção de ROS é maior que a produção de NO nos pacientes com LC. A produção de NO foi maior nos pacientes LC quando comparado com a produção por células dos indivíduos SC bem como a produção de ROS que também foi maior nos pacientes com LC, porém sem diferença estatística. A produção de NO apresentou uma correlação positiva com o tamanho das lesões dos pacientes com LC. Após 72 horas de infecção houve diminuição significativa no número de células infectadas e na carga parasitária nas culturas de células que tiveram a NADPH oxidase inibida. Esses resultados foram associados com a viabilidade das promastigotas no mesmo período de tempo e nas mesmas condições. Conclusões: Esses resultados sugerem que a produção de ROS e não de NO parece ser importante no controle da infecção por L. braziliensis por monócitos de pacientes com LC. Adicionalmente, a produção dessa molécula parece estar mais associada ao desenvolvimento da lesão nesses pacientes. Em relação aos indivíduos subclínicos não existe indicação que essas moléculas estejam envolvidas no controle da infecção